在這里，我們介紹TwistAmp®液體，一種新的PCR替代形式，使RPA技術(shù)更適用于廣泛的研究應(yīng)用。與PCR擴(kuò)增相比，RPA只需幾分鐘，而不是幾個(gè)小時(shí)，可以運(yùn)行不需要額外設(shè)備。TwistAmp®Liquid Basic和Basic試劑盒可用于需要良好保真度，凝膠電泳或固相檢測的應(yīng)用。TwistAmp®Liquid exo和exo允許快速實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測目標(biāo)而不犧牲靈敏度或特異性。

概述

      圖1:RPA循環(huán)，重組酶蛋白與引物形成重組絲，并將其插入DNA雙螺旋的互補(bǔ)位點(diǎn)，形成d環(huán)。單鏈dna結(jié)合(SSB)蛋白穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)和d環(huán)的開放。重組酶的分解允許鏈置換聚合酶沿著目標(biāo)序列延伸引物的3端。當(dāng)對相反的引物重復(fù)這個(gè)序列時(shí)，指數(shù)擴(kuò)增發(fā)生而不需要熱變性或退火。

      自2008年推出以來，TwistAmp®試劑盒為科學(xué)家提供了一種簡單的方法來進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)，迄今為止已有250多篇關(guān)于該技術(shù)的同行評審出版物。RPA是一種等溫替代聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，它使用三種蛋白質(zhì)(重組酶，單鏈dna結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶)來代替熱循環(huán)(圖1)。RPA在恒定低溫下(理想情況下為37-42°C)效果，反應(yīng)速度非?？?反應(yīng)時(shí)間小于20分鐘)，可以用穩(wěn)定的凍干顆粒啟動(dòng)，這使得它非常適合即時(shí)測試。此外，RPA用戶已經(jīng)在各種不同的應(yīng)用中測試了TwistAmp®試劑盒試劑，包括那些傳統(tǒng)上使用PCR的試劑(如最近對RPA應(yīng)用的回顧所述1)。與PCR一樣，簡單的RPA使用兩種相反的引物以指數(shù)方式擴(kuò)增DNA的特定區(qū)域。RPA引物對遵循與PCR引物相似的設(shè)計(jì)規(guī)則，并且為PCR反應(yīng)開發(fā)的引物通常在RPA反應(yīng)中表現(xiàn)良好。

關(guān)于TwistAmp®Liquid試劑盒

     為了鼓勵(lì)這種多為了鼓勵(lì)這種多用途的RPA技術(shù)，TwistDx™開發(fā)并推出了TwistAmp®液體試劑盒，為用戶提供更靈活的試劑。TwistAmp®Liquid試劑盒類似于在每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室冷凍室中發(fā)現(xiàn)的預(yù)制PCR master mixes，包括核心RPA蛋白混合物的甘油儲(chǔ)存管，一管緩沖液，一管驅(qū)動(dòng)重組過程所需的能量混合物和一管用于蛋白質(zhì)的醋酸鎂輔助因子。

      有四種TwistAmp®液體試劑盒可用:基本和基本RT擴(kuò)增無探針，適用于凝膠電泳，固相擴(kuò)增和微陣列應(yīng)用與尾部引物和適配體;exo和exo RT，它們與基于探針的實(shí)時(shí)檢測方法兼容。所有四個(gè)試劑盒包含相同的核心反應(yīng)混合物，重組酶，單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶的比例與凍干的TwistAmp®基本試劑盒相同。因此，當(dāng)使用液體試劑盒時(shí)，使用凍干的TwistAmp®基本試劑盒進(jìn)行的分析當(dāng)然應(yīng)該表現(xiàn)得非常相似，但使用其他凍干的TwistAmp®試劑盒進(jìn)行的分析在使用液體試劑盒時(shí)可能會(huì)顯示出不同的分析性能。圖2顯示：使用TwistAmp®exo RT和TwistAmp®Liquid exo RT進(jìn)行的檢測均檢測到50份人呼吸道合胞病毒B RNA模板。除了Core Reaction Mix外，exo試劑盒還包含一管外切酶III，用于處理TwistAmp®外切酶探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，RT試劑盒包含一管逆轉(zhuǎn)錄酶，用于將RNA單步轉(zhuǎn)化為cDNA并隨后擴(kuò)增。

     TwistAmp®液體試劑盒，類似于他們的凍干對應(yīng)試劑盒，配制允許擴(kuò)增片段高達(dá)500個(gè)堿基對的大小，這足以用于許多常見的PCR實(shí)驗(yàn)室用途(不同的蛋白質(zhì)制劑正在開發(fā)，以允許更長的擴(kuò)增子)。這使得RPA成為許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室克隆和測序方案中取代PCR的優(yōu)秀候選者。當(dāng)用于Illumina下一代測序文庫制備時(shí)，RPA比校對聚合酶(如Kapa HiFi和Platinum pfx2)導(dǎo)致的錯(cuò)誤更少。此外，在為合成生物學(xué)開發(fā)的端到端自動(dòng)化微流控平臺上，利用Gibson克隆的等溫變體，RPA已被用于生成更長的754堿基對片段，從而證明了在已建立的聚焦pcr方案中成功實(shí)施RPA。

TwistAmp®Liquid試劑盒優(yōu)勢

      與凍干的TwistAmp®試劑盒相比，TwistAmp®Liquid的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是，科學(xué)家可以根據(jù)需要使用盡可能多或盡可能少的TwistAmp®試劑，在他們選擇的容器中進(jìn)行反應(yīng)。與PCR不同的是，RPA是等溫的，在相對較低的最佳溫度下工作，并且可以耐受過低溫度和溫度波動(dòng)。在將主混合物輸送到反應(yīng)體系之前不需要預(yù)熱，并且在較低的等溫溫度下，蒸發(fā)和冷凝的影響不是主要問題。這意味著在小的、分區(qū)的微流體裝置體積中的熱控制得到了簡化:RPA已被證明可以在非常小的(皮升)體積中工作4。RPA的這些屬性也意味著它可以用于比PCR理想的更大體積的反應(yīng)。圖3顯示：一對PCR引物5成功擴(kuò)增了淋病奈瑟菌269堿基對片段，反應(yīng)量為2.5 ~ 5000微升。因此，TwistAmp®液體反應(yīng)可以在從定制的微流體裝置到標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室96孔板到微離心管，甚至更大的容器中運(yùn)行。

選擇TwistAmp®液體試劑盒而不是凍干TwistAmp®試劑盒的科學(xué)家有更多的選擇性，因?yàn)門wistAmp®液體試劑盒不包括脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此，可以用三磷酸脫氧尿苷(dUTP)或標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行檢測，以允許擴(kuò)增子捕獲或比色或電化學(xué)檢測6 - 8。

總結(jié)

RPA已在250多項(xiàng)外部研究中得到應(yīng)用，并在眾多應(yīng)用和領(lǐng)域中越來越具有優(yōu)勢。我們的新型TwistAmp®液體是實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)研究中第一個(gè)可行的PCR替代品。

1. Lobato, I.M. & O’Sullivan, C.K. Trends Analyt. Chem. 98, 19–35 (2018).

2. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).

3. Linshiz, G. et al. J. Biol. Eng. 10, 3 (2016).

4. Li, Z. et al. PLoS One 11, e0153359 (2016).

5. Sachdev, D., Patel, A.L., Sonkar, S.C., Kumari, I. & Saluja, D. Biomed Res. Int. 2015,

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6. Koo, K.M., Wee, E.J. & Trau, M. Theranostics 6, 1415–1424 (2016).

7. Wee, E.J., Ngo, T.H. & Trau, M. Clin. Epigenetics 7, 65 (2015).

8. Lau, H.Y. et al. Sci. Rep. 7, 38896 (2017). 

默瑞生物

默瑞(上海)生物科技有限公司，作為專業(yè)的生命科學(xué)產(chǎn)品推廣與服務(wù)商，以“創(chuàng)新，專業(yè)，共贏"的理念，不斷強(qiáng)化服務(wù)體系，提升客戶體驗(yàn)，結(jié)合國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提供高標(biāo)準(zhǔn)完整解決方案，幫助科研客戶和生物技術(shù)企業(yè)高效創(chuàng)新，加速轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造更多優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，提升社會(huì)福祉，實(shí)現(xiàn)多方共贏。

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